作者： 刘亚萍 发布时间：2019-12-20 16:24 阅读：
遗传密码子扩展技术是研究和操纵蛋白质功能的强有力的工具。该技术能够将具有一种或者多种功能（如带有翻译后修饰的，正交反应基团的，光交联基团的，光保护基团）非天然氨基酸定点插入到感兴趣的蛋白中。经过科学家20多年的努力，现在已经实现了对200多种非天然氨基酸的定点插入。但是，很多工程化的氨酰tRNA合成酶都有一个共同的缺陷：底物选择性差，也就是可以识别多种非天然氨基酸。比如p-氰基-L-苯丙氨酰tRNA合成酶(pCNFRS)至少可以识别18种非天然氨基酸，包括p-氰基-L-苯丙氨酸，p-叠氮基-L-苯丙氨酸以及其它苯环对位取代的苯丙氨酸衍生物。因此，当培养基中同时含有多种非天然氨基酸，尤其是从同一个天然氨基酸衍生得到的非天然氨基酸时，很难实现对某一种非天然氨基酸的定点插入。在本文中，作者采用直接进化的策略(如图1)显著提高了氨酰tRNA合成酶对特定非天然氨基酸的选择性。该策略首先通过易错PCR建立一个包含多种TAG突变的氨酰tRNA合成酶库，然后在多种非天然氨基酸同时存在下，进行两轮正向的筛选。第一轮筛选是利用包含TAG的氯霉素乙酰转移酶及同源的tRNACUA找到具有活性的氨酰tRNA合成酶。第二轮筛选则是用带有TAG的报告蛋白及同源的tRNA，结合特定氨基酸的性质，通过流式细胞仪找到能识别该氨基酸的氨酰tRNA合成酶。然后将分选出来的细菌涂布到LB固体培养基上，通过GFP的读通实验来验证筛选出来的合成酶对特定底物的选择性。以前传统的筛选方法是基于读通含有TAG的报告基因进行的筛选，这篇文章发展的策略是利用流式细胞仪对底物选择性的读出进行的筛选，所以得到的氨酰tRNA合成酶可以区别结构相似的非天然氨基酸。
图1. 两轮正向进化的策略图
作者的第一个案例是，利用该策略提高了p-氰基-L-苯丙氨酰tRNA合成酶 (pCNFRS) 对底物的选择性(见图2)。首先，他们用易错PCR构建了4.6*10e7容量的tRNA合成酶突变库，通过第一轮的氯霉素乙酰转移酶筛选找到能同时识别p-叠氮基-L-苯丙氨酸(pAzF)和p-氰基-L-苯丙氨酸(pCNF)的pCNFRS突变体。然后将该突变库转入表达sfGFP-2TAG和同源 tRNACUA的E. coli中，让细菌在含有pAzF和pCNF中培养基生长，随后加入DBCO-Cy5来检测pAzF在sfGFP中的插入。通过流式细胞仪可以分选出两类细胞：Cy5+/GFP+的细胞(该类细胞中含有主要识别pAzF的pCNFRS突变体)，Cy5-/GFP+的细胞(该类细胞中含有主要识别pCNF的pCNFRS突变体)。然后将分选的细菌种在只含有pAzF或者pCNF固体培养基中，通过sfGFP的读通来评估突变体对底物的选择性。最后作者找的突变体pAzFRS-1可以高选择性的插入pAzF。与pCNFRS相比，pAzFRS-1对pCNF的插入降到2倍以下。
图2. 对pAzF选择性识别的氨酰tRNA合成酶的进化
另外的一个案例是，作者用该策略提升Nε-乙酰基-赖氨酰tRNA合成酶 (AcKRS)的底物选择性(见图3)。AcKRS除了可以识别Nε-乙酰基-赖氨酸(AcK)，还可以识别m-碘-L-苯丙氨酸 (mIF)，m-溴-L-苯丙氨酸 (mBrF)，m-三氟甲基-L-苯丙氨酸 (mCF3F)，m-甲氧基-L-苯丙氨酸 (mMeOF)。同样地，通过第一轮的氯霉素乙酰转移酶筛选找到能同时识别AcK和mIF的AcKRS的突变体。然后将该突变库转入表达Lpp-OmpA-H3-9TAG-His6和同源 tRNACUA的E. coli中，让细菌在含有AcK和mIF中培养基生长，随后加入anti-His6 (FITC) 和 anti-acetyl H3K9 (PE) 抗体。通过流式细胞仪可以分选出两类细胞胞：FITC+/PE+的细胞(该类细胞中含有主要识别AcK的AcKRS突变体)，FITC-/PE+的细胞(该类细胞中含有主要识别mIF的AcKRS突变体)。然后将分选的细菌种在只含有AcK和mIF固体培养基中，通过sfGFP的读通来评估突变体对底物的选择性。最后作者找到的突变体mIFRS-1可以高选择性的插入mIF。与AcKRS相比，mIFRS-1对AcK的插入降到7倍以下。
图3. 对mIF选择性识别的氨酰tRNA合成酶的进化
这两个应用表明本文中发展的策略可以作为一个通用的方法将多特异性的tRNA合成酶进化成高选择性的tRNA合成酶。该课题组未来的目标是利用PTM特异性的抗体进化出高选择性识别PTM的tRNA合成酶，以及利用和反式环辛烯反应的四嗪探针进化出识别环辛烯类非天然氨基酸的tRNA合成酶。这个策略为发展下一代对特定ncAA有高选择性的合成酶提供了思路。
文章作者：刘亚萍 (来自陈鹏课题组供稿)